فهرست:
چکیده: 1
فصل اول: کلیات 2
1-1- بیان مسئله. 3
1-2- اهداف پژوهش.. 4
1-3- فرضیات اصلی پژوهش.. 4
1-41- جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق. 4
فصل دوم: مروری بر مطالعات گذشته 5
2-1-آمیلاز 6
2-1-1- تاریخچه. 6
2-1-2- آمیلاز در تکامل انسان. 6
2-1-3- کارکردهای آمیلاز 7
2-1-4- ساختار آمیلاز 9
2-1-5- اندازه گیری سطح خونی. 9
2-2- آلفا آمیلاز 10
2-2-1-کارکرد آلفاآمیلاز 11
2-2-2- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان. 12
2-3- آمیلاز بزاقی یا Ptyalin 12
2-3-1- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی. 12
2-4- آلفا آمیلاز پانکراس 13
2-5- آلفا آمیلاز در پاتولوژی 13
2-5-1- تفسیر میزان آلفا آمیلاز 13
2-6- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز 14
2-7- مطالعه فعالیت آنزیم 14
2-7-1- روشهای اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی. 14
2-7-2 - روشهای رنگ سنجی : 15
2-8- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain) 15
2-9- ژن های آلفا آمیلاز در انسان 16
2-10- آلفا آمیلاز در موش 18
2-10-1-تفاوت توالی انتهای 5 mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه 19
2-10-2- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20
2-10-3- خصوصیات mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20
2-11- مهار کننده های آلفا آمیلاز 21
2-11-1- چای سبز 22
2-11-2- فواید چای سبز 22
2-11-2-1-جلوگیری از بیماری گرفتگی رگها 23
2-11-2-2-تاثیر چای سبز روی افراد مبتلاء به تری گلیسیرید. 24
2-11-2-3-رقیق شدن خون و جلوگیری از لخته شدن آن. 24
2-11-2-4-کاهش فشار خون و جلوگیری از ابتلاء به آن. 24
2-11-2-5-حداقل رساندن میزان صدمات وارد شده به مغز و قلب.. 25
2-11-2-6-حفاظت در مقابل انواع سرطان. 25
2-11-2-7-جلوگیری از دیابت نوع 2. 25
2-11-2-8-کاهش وزن. 26
فصل سوم مواد و روشها 27
3-1- روش های اجرایی کار : 28
3-1-1- حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه : 28
3-1-1-1-دلایل انتخاب این حیوان به طور خلاصه عبارتند از : 28
3-1-1-2-شرایط نگه داری حیوانات : 28
3-1-2- نوع مطالعه 29
3-2- روش اجرای طرح (چاق کردن موش ها با استفاده از رژیم غذایی با چربی بالا) 29
3-2-1- تهیه عصاره ی آبی و الکلی چای سبز 30
3-2-2- جدا سازی کبد و خونگیری از قلب موش.. 30
3-3- استخراج RNA 34
3-3-1- وسایل کار استخراج RNA. 34
3-3-2- مراحل استخراج RNA.. 34
3-3-2-1- رسوب دادن RNA : 35
3-3-2-2- شستشوی RNA : 35
3-3-2-3- خشک کردن رسوب RNA : 35
3-3-3- ارزیابی کمی و کیفی RNA استخراج شده: 36
3-3-3-1- اندازه گیری مقدار RNA : 36
3-3-3-2- بررسی کیفی RNA : 36
3-3-3-3- حفظ و نگهداری RNA: 37
3-4- بررسی بیان ژن 37
3-4-1- RT-PCR. 37
3-4-2- تکثیر cDNA. 39
3-4-2-1- PCR(Polymerase Chain Reaction) 39
3-4-2-2- مواد و وسایل مورد نیاز برای ساخت cDNA.. 43
3-4-2-3- روش انجام آزمایش ساخت cDNA. 44
3-4-2-4- نحوه انجام واکنش RT-PCR برای اطمینان از صحت سنتز cDNA.. 45
3-4-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز 47
3-4-2-6- دستگاههای مورد نیاز برای الکتروفورز 47
3-4-2-7- مواد لازم برای الکتروفورز 47
3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز 48
3-4-2-9- آشکار سازی ژل. 48
3-5- Real time PCR 49
3-5-1- موارد استفاده از Real-time PCR. 49
3-5-2- فازهای مختلف یک واکنش Real time PCR. 50
3-5-3- روشهای سنجش با Real-time PCR. 51
3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR.. 51
3-5-4- مفهوم Threshold وCt. 52
3-5-5- نحوه رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) 53
3-5-6- نحوه انجام Real time PCR. 55
3-5-6-1- مواد لازم برای انجام Real time PCR. 55
3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR. 55
3-5-6-3- آنالیز آماری 57
3-6-اندازه گیری α-Amylase در سرم موش: 57
3-6-1- جداسازی سرم از خون موش.. 57
3-6-2- اندازه گیری α-Amylase در سرم روش فتومتریک.. 57
فصل چهارم نتایج.. 60
4-1- مشاهدات افزایش وزن موش های گروه تست 61
4-2- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده 66
4-3- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR 67
4-4-آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) 68
4-4-1- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال. 70
4-4-2-اثر چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روی موش های چاق. 71
4-5- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک 72
فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری 73
5-1- بحث و نتیجه گیری 74
5-2-پیشنهادات 81
منابع 83
خلاصه انگلیسی 92
منبع:
Abe,A., Yoshida,H., Tonozuka,T., Sakano,Y., Kamitori,S.,2005, Complexes of Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 1 and pullulan model oligossacharides provide new insight into the mechanism for recognizing substrates with alpha-(1,6) glycosidic linkages,FEBS J,Vol.272,No.23,p.6145–6153.
Aghajari, N., [etal].,1998, Crystal structures of the psychrophilic alpha-amylase from Alteromonas haloplanctis in its native form and complexed with an inhibitor, Protein Sci,Vol.7,No.3,p. 564–572 .
Aguiar,L.G.K.,Villela,N.R.,Bouskela,E.A.,2007, Microcirculação no Diabetes: Implicações nas Complicações Crônicas e Tratamento da Doença,Arq Bras Endocrinol Metab ,Vol. 51,p.204-211.
Ammann ,R.W., Berk, J.E., Fridhandler, L., Ueda, M., Wegmann,W.,1973, Hyperamylasemia with carcinoma of the lung,Ann Intern Med ,Vol.78,p.521–526.
Bernfeld,P.,1955,Methods in Enzymology, Cell-wide Metabolic Alterations Associated with Malignancy, Vol.1,p.149-158.
Booth,T., [etal].,1948, Theory of Electrokinetic Effects,Nature,Vol.161,No. 4081,p.83-86.
Bose,M., [etal].,2008,The major green tea polyphenol, (−)-epigallocatechin-3-gallate, inhibits obesity, metabolic syndrome, and fatty liver disease in high fat-fed mice,J Nutr,Vol. 138,p.1677–1683.
Brayer,G.D.,Luo, Y., Withers,S.G.,1995, The structure of human pancreatic a-amylase at 1.8 A resolution and comparisons with related enzymes,Protein Sci,Vol.4,p.1730-1742.
Burtis,C.A., ash wood,E.R., 1999,enzymes amylase, 3rd ed .Philadelphia: W.B Saunders company,p.616-19.
Cabrera,C., Artacho ,R., Giménez ,R., 2006, Beneficial Effects of Green Tea--A Review, J Am Coll Nutr,Vol. 25,No.2,p.79–99.
Célio,L., [etal].,2010, Oleanolic acid, a natural triterpenoid improves blood glucose tolerance in normal mice and ameliorates visceral obesity in mice fed a high-fat diet,Chemico-Biological Interactions,Vol.185,p. 59–66.
Cheng,A.Y., Fantus, I.G.,2005, Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes Mellitus , Can. Med. Assoc. J, Vol. 172,p.213-226.
Cramer, S., Bruns, D.E.,1979, Amylase-producing ovarian neoplasm with pseudo-Meigs’ syndrome and elevated pleural fluid amylase, Cancer, Vol.44,p.1715–1721.
Danilewsky, A., [etal].,1862,On the specifically-acting principles of the natural and artificial pancreatic juice, Virchows Archiv für pathologische Anatomie und Physiologie, und für klinische Medizin, Vol. 25, P. 279-307.
Davison,W.C.,1925,A Viscosimetric Method for the Quantitative Determination of Amylase, Bulletin of Johns Hopkins Hospital,Vol. 37,p.281-282.
Elman, R., McCaughan, J.M.,1927,The Quantitative Determination of Blood Amylase with the Viscosimeter,Archive of Internal Medicine,Vol.40,p.58-64.
Fried, M., Abramson, S., Meyer, J.H., 1987,Passage of salivary amylase through the stomach in humans,Digestive Diseases and Sciences ,Vol.32,p.1097-1103.
Frost ,S.J., 1978,A simple quantitative index of the P3 amylase isoenzyme in the diagnosis of acute pancreatitis,Clin Chim Acta,vol.87,p. 23–8.
Fuwa,H., [etal].,1954,A new method of microdetermination of amylase activity by the use of amylase as the substrate, Journal of Biochemistry,Vol.41,p.583–603.
Ghalanbor, Z., [etal]., 2008, Binding of Tris to Bacillus licheniformis alpha-amylase can affect its starch hydrolysis activity, Protein Peptide Lett, Vol.15,No.2,p. 212–214.
Giricz,O.,Lauer-Fields,J.L.,Fields,G.B., 2008, The normalization of gene expression data in melanoma: investigating the use of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and 18S ribosomal RNA as internal reference genes for quantitative real-time PCR, Anal Biochem,Vol.380,p.137-139.
Groot,P.C., [etal].,Human pancreatic amylase is encoded by two different genes,Nucleic Acids Res,Vol.16,p.4724.
Gumucio,D.L., [etal].,1985, Evolution of the amylase multigene family. YBR/Ki mice express a pancreatic amylase gene which is silent in other strains,J Biol Chem,Vol,260,No.25,p.13483-13489.
Gumucio,D.L., Wiebauer, K.,Caldwell,R.M.,Samuelson,L.C., Meisler,M.H., Concerted evolution of human amylase genes,Mol Cell Biol,Vol.8,p.1197-1205.
Hagenbüchle,O., [etal].,1981,Mouse liver and salivary gland alpha-amylase mRNAs differ only in 5' non-translated sequences,Nature,Vol.19,No.289(5799),p.643-646.
Hill, R., Needham, j., 1970,The Chemistry of Life: Eight Lectures on the History of Biochemistry ,London: Cambridge University Press, p.17-22.
Hoff,J., [etal]., 2000, Methods of Blood Collection in the Mouse, Lab Animal, Vol.29, No.10,p.47-53.
Hohenwallner ,W.,[etal].,1989,Reference ranges for alpha amylase in serum and urine with 4,6 ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenyl-(g1)-alpha ,D-maltoheptaoside as substrate, J clin chem Biochem,Vol.27,p.97-101.
Huggins, C., Russell, P.S., 1948, Colorimetric Determination Of Amylase,Annals of Surgery ,Vol.128,No.4,p.668-678.
JAMES,E., [etal].,1981,Mouse liver cell culture, IN VITRO,Vol. 17, No. 10, p.926-930.
Kadziola,A., Søgaard,M., Svensson,B., Haser,R.,1998,Molecular structure of a barley alpha-amylase-inhibitor complex: implications for starch binding and catalysis, J. Mol. Biol.,Vol.278,No.1,p.205–217.
Kadziola,A.,Abe,J., Svensson,B., Haser,R.,1994,Crystal and molecular structure of barley alpha-amylase, J. Mol. Biol,Vol.239,No.1,P.104–121.
Kanno,T., [etal].,1975,The electrogenic sodium pump in the hyperpolarizing and secretory effects of pancreozymin in the pancreatic acinar cell, Journal of Physiology ,Vol. 245,p.599.
Koyama, I., [etal]., 2001,Expression of alpha-amylase gene in rat liver: liver-specific amylase has a high affinity to glycogen, Electrophoresis,Vol.22,p. 12-17.
Koyama, I., [etal].,2002, Electrophoretically unique amylases in rat livers: phylogenic and ontogenic study on the mammalian liver,Electrophoresis,Vol.23,No. 19,p.3278-3283.
Koyama,I.,[etal].,2001,Expression of a-amylase gene in rat liver: liver-specific amylase has high affinity to glycogen,Electrophoresis,Vol.22,p.12–17.
Kruse-jarres, J,D.,[etal].,1989, Evaluation of new alpha amylase assay using 4,6 ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenyl-(g1)-alpha ,D-maltoheptaoside as substrate ,J clin chem Biochem ,Vol.27,P.103-113.
Leuchs, E.F., 1831, Wirkung des Speichels auf Stärke (Effect of saliva on starch), Poggendorff's Annalen der Physik und Chemie, Vol. 98, No.8, p. 623-628.
Lwao,T., [etal].,2001,Expression of α-amylase gene in rat liver. Liver specific amylase has a high affinity to glycogen,electrophoresis,Vol.22,No.12,p.177.
Macgeachin,R.L., Potter,B.A.,1960,Amylase in isolated liver cells,J. Biol. Chem,Vol.235,p.1354-1358.
Machius, M., Wiegand ,G., Huber, R, 1995, Crystal structure of calcium-depleted Bacillus licheniformis alpha-amylase at 2.2 A resolution, J. Mol. Biol,Vol. 246,No. 4,p.545–549.
Machius,M., Wiegand,G., Huber,R.,1995,Crystal structure of calcium-depleted Bacillus licheniformis alpha-amylase at 2.2 A resolution, J. Mol. Biol,Vol.246,No.4,p.545–559.
Mapp, C.E., 2001,Agents, old and new, causing occupational asthma, Occup Environ Med,Vol. 58,No. 5,P. 354–60.
Maton, A., [etal]., 1993, Human Biology and Health,New Jersey:Englewood Cliffs, p. 132–144.
Maureen,B.P.,2000, Stedman's Medical Dictionary, 27th ed, Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins,p. 65.
McKay,D.L., Blumberg ,J.B.,2002,The role of tea in human health: An update,J Am Coll Nutr,Vol.21,p.1–13.
Meisler ,M.H.,Ting,C.N., 1993, The remarkable evolutionary history of the human amylase genes,Crit Rev Oral Biol Med,Vol.4,No.4,p.503-509.
Meisler,M.H.,Ting,C.N.,1993,The remarkable evolutionary history of the human amylase genes,Crit Rev Oral Biol Med,Vol.4,p.503-509.
Moss,D.W., Henderson,A.R.,1999,Digestive enzymes of pancreatic origin, 3rd ed.Philadelphia: W.B Saunders company, p.689-98.
Najafi,M.F., Kembhavi,A.,2005,One step purification characterization of an extracellular alpha-amylase from marine Vibrio sp,Enzyme and Microbiology Technology,Vol. 36,p. 535–539.
Obiro,W.C.,Zhang,T.,Jiang,B.,2008,The nutraceutical role of the Phaseolus vulgaris alpha-amylase inhibitor,Br J Nutr,Vol.100,p.1-12.
Overbergh,L.,[etal].,2003,The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression,J Biomol Tech,Vol.14,p.33-43.
Payen, A., Persoz,J.F., 1833, Memoir on diastase, the principal products of its reactions and their applications to the industrial arts, Annales de Chimie et de Physique, 2nd series,Vol. 53,p.73–92.
Perry, G.H., 2007,Diet and evolution of human amylase gene copy number variation, Nature Genetics,Vol. 39,p.1256-1260.
Preuss,H.G., [etal].,2009, Bean amylase inhibitor and other carbohydrate absorption blockers: effects on diabesity and general health, J Am Coll Nutr,Vol. 28,p.266-276.
Ramasubbu ,N.,Paloth,V.,Luo,Y.,Brayer, G.D.,Levine, M.J., Structure of human salivary alpha- amylase, Biol. Crystallogr,Vol. 52,p. 435-437.
Saiki,R.,[etal].,1988,Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science,Vol.239,No. 4839,p. 487–491.
Samuelson,L.C.,Phillips,R.S.,Swanberg,L.J.,1996, Amylase gene structures in primates: retroposon insertions and promoter evolution,Mol Biol Evol,Vol.13,No.6,p.767-779.
Schibler,U., [etal].,1980,Tissue-specific expression of mouse alpha-amylase genes, J Mol Biol.vol.5,No.1,p.93-116.
Schibler,U., [etal].,1982,The mouse a-amylase multiple family: sequence organization of members expressed in the pancreas, salivary gland and liver,J Mol Biol,Vol.155,p.247–266.
Semenza,G.,1987, Mammalian ectoenzymes, B.V. Elsevier Science Publishers,p.265-287. Shaffer,P.A., Somogyi, M., 1933, Copper-Iodometric Reagents for Sugar Determination, Journal of Biological Chemistry ,Vol.100,p.695-713.
Shimamura, J., Fridhandler, L., Berk, J,E.,1976, Nonpancreatic-type hyperamylasemia associated with pancreatic cancer, Am J Dig Dis,Vol.21,p.340–345.
Souaze,F.,[etal].,1998,Quantitative RT-PCR: limits and accuracy,Biotechniques ,Vol.21,p.280-285.
Tadera, K., Minami, Y.,Takamatsu,K., Matsuoka, T.,2006,Inhibition of a-Glucosidase and a-Amylase by Flavonoids,J Nutr Sci Vitaminol,Vol.52,p.149-153.
Thomas,L., 1998, clinical laboratory diagnostic,Frankfurt: TH-books .verlagsgesellschaft,p.131-137.
Tricoli, J.V., Shows, T.B.,1984, Regional assignment of human amylase amylase of chromosome 1, Somatic Cell Mol Genet, Vol.10,p.205–210.
Tsujino, S., [etal]., 1973,Glycogen metabolism,Physiol. Rev,Vol.40,p.505-537.
Udani, J., Hardy ,M., Madsen, D.C., 2004, Blocking carbohydrate absorption and weight loss: a clinical trial using Phase 2 brand proprietary fractionated white bean extract, Altern Med Rev,Vol. 9, No.1,p.63–9.
VanGuilder,H.D.,Vrana,K.E. Freeman,W.M.,2008,Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis, Biotechniques,Vol.44,No.5,p.619–626.
Voet, D., Voet, J.G., 2005, Biochimie,2e ed.Bruxelles: De Boeck.
Vuorisalo, T., Arjamaa, O.,Gene-Culture Coevolution and Human Diet,American Scientist,Vol.98,No.2,p.34-40.
Whetzel, L.C., Thownsend,M.E.,1975, Reagents and methods for determining amylase concentrations,United States Patent3,p.739-888.
World Health Organization, 2006,Obesity and overweight, Available from: http://www. who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/index.html Accessed May 30, 2014.
Xiao,Z., Storms, R.,Tsang ,A.,2006, A quantitative starch-iodine method for measuring alpha-amylase and glucoamylase activities, Analitical Biochemistry,Vol.351,No.1,p.146-148.
Yeyi ,G.u., Sarah,C., Forester,D., Joshua ,D., Lambert,S.,2012, Inhibition of starch digestion by the green tea polyphenol, (−)-epigallocatechin-3-gallate, Molecular Nutrition & Food Research, 2012,Vol. 56,No.11,p. 1647-1654.
Yokouchi, H., [etal].,1990,Cloning and characterization of a third type human a-amylase gene, AMY-2B,Gene, vol.90,p.281–286.
Zahedi, F., Larijani, B ., Aghakhani,SH.,2002, Epidemiology of Diabetes Mellitus in Iran, Iranian Journal of diabetes and lipid disorders ,vol.1,no.1,p.1-8.
Zumbo,P.,2010,Phenol-chloroform Extraction,WEILL CORNELL MEDICAL COLLEGE LABORATORY OF CHRISTOPHER E. MASON, PH.D. DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY & BIOPHYSICS,p.137-139.