پایان نامه مقایسه خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان

فهرست:

چکیده: .............................................................................................. 1

فصل اول: مقدمات و کلیات

1-1-بیان مسئله ................................................................................... 3

1-2-اهداف تحقیق .............................................................................. 4

1-3-فرضیه های تحقیق........................................................................ 4

1-4- مفهوم نانوتکنولوژی ..................................................................... 5

1-4-1-کاربردهای نانوتکنولوژی.............................................................. 5

1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی................................................ 5

1-4-1-2- پزشکی و بدن انسان.............................................................. 6

1-4-1-3- پایداری منابع......................................................................... 6

1-4-1-4- صنایع غذایی......................................................................... 6

1-5-آنزیم ها....................................................................................... 8

1-5-1-خصوصیات آنزیم ها.................................................................... 8

1-5-2- خصوصیات واکنشهای آنزیمی...................................................... 11

1-5-3- پارامترهای موثر بر واکنشهای آنزیمی........................................... 14

1-5-3-1- دما....................................................................................... 14

1-5-3-2-pH ........................................................................................ 14

1-5-3-3-بازدارنده­ها............................................................................ 15

1-5-4- سینتیک واکنش آنزیمی............................................................... 16

1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعالیت آنزیمها ......................................... 17

1-5-5-1-اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی............................. 17

1-5-6- معادله میکائیلیس- منتن............................................................. 18

1-5-7- معادله لینویور- برک .................................................................. 21

1-5-8- آنزیم لیپاز................................................................................. 23

1-5-8-1-کاربرد لیپاز.............................................................................. 25 

1-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز............................................................... 27

1-5-8-3-روش های اندازه­گیری فعالیت لیپاز........................................... 28

1-6- تثبیت آنزیم .................................................................................. 30

1-6-1- انتخاب پایه و روش مناسب جهت تثبیت آنزیم................................. 31

1-7- کیتین و کیتوسان .......................................................................... 32

1-7-1- کیتین....................................................................................... 33

1-7-2- کیتوسان................................................................................... 34

1-7-2-1- کاربردهای کیتوسان................................................................ 35

1-8-تعیین مشخصات نانوذرات کیتوسان ................................................. 38

فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1-مروری برمطالعات آنزیمی ............................................................. 41

2-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز ............................................................ 42

2-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان ....................................................... 44

2-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات .................................................. 45

2-5-تحقیقات پیشین در این زمینه .......................................................... 46

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- مقدمه ........................................................................................ 51

3-2-مواد شیمیایی ............................................................................... 52

3-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز ..................................................... 54

3-3-1-ظروف آزمایشگاهی................................................................... 54

3-3-2-دستگاه­ها.................................................................................. 54

3-4-روش­های آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه ....................... 58

3-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان ............................................................. 58

3-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز  به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف 59

3-4-3-تعیین خصوصیات نانو ذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی     60

3-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسایزر  61

3-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) ................................................ 62

3-4-6- اندازه­گیری پروتئین تام به روش برادفورد..................................... 62

3-4-7-اندازه­گیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان. 63

3-4-8-اندازه­گیری فعالیت آنزیم لیپاز....................................................... 63

3-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز.................................................... 64

3-4-8-2-روش اول- اندازه­گیری فعالیت لیپاز به روش کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC)  در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک............................................. 66

3-4-8-3-روش دوم- اندازه­گیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP)......................................................................................................... 68

3-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان    68

3-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان   69

3-4-11-بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان    69

فصل چهارم: نتایج

4-1-مقدمه ......................................................................................... 71

4-2-تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ........................ 71

4-3-طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) ................................. 72

4-4-توزیع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سایزر .................... 74

4-5-فعالیت لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان ...... 75

4-6-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان     76

4-7-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف    77

4-8-بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان ......................................................................................................... 78

4-9-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در دماهای مختلف      79

4-10-پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان          80

فصل پنجم: بحث و نتیجه­گیری

بحث................................................................................................... 83

نتیجه گیری ......................................................................................... 87

مشکلات وپیشنهادات ........................................................................... 89

منابع و مآخذ........................................................................................ 90

فهرست منابع فارسی........................................................................... 91

فهرست منابع غیر فارسی..................................................................... 92

چکیده انگلیسی................................................................................... 100

منبع:

 ]1[ عالم زاده؛ ایران، 1377،فرایند های آنزیمی ، موسسه انتشارات دانشگاه صنعتی شریف.

 [2]  وثوقی؛ منوچهر، 1380،  مهندسی بیوشیمی، موسسه انتشارات دانشگاه صنعتی شریف.

[3] دوره اول- شماره سوم ،اسدپور، یوسفعلی، شجاع الساداتی، سید عباس ، کلباسی، محمدرضا، و خسروشاهی ، اصغر، 1382، استحصال کیتین و تبدیل آن به کیتوسان از پوسته سیست آرتمیا اورمیانا با فن آوری زیستی، مجله علوم دریایی ایران ، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی دانشگاه تربیت مدرس، ص 1-9.

[4] مبارک قمصری، الهه، کسری کرمانشاهی، روحا، و موسوی نژاد، زهرا،. 1389، بررسی تاثیر pH در پایداری و فعالیت لیپاز سودوموناس آئروژینوزا جداسازی شده از پساب روغنی، چهارمین همایش تخصصی مهندسی محیط زیست، تهران، دانشگاه تهران، دانشکده محیط زیست. ص 1-5.

]5[ 5 ،20، دوستگانی، امیر، واشقانی فراهانی، ابراهیم، ایمانی ، محمد، 1386، تعیین شرایط بهینه تهیه نانوذرات از پلیمر طبیعی کیتوسان، مجله علوم و تکنولوژی پلیمر،هشتمین سمینار بین المللی علوم و تکنولوژی پلیمر،ص 464-457.

منابع غیر فارسی:

Refrence:

[6] Roco MC.(2003),Nanotechnology: convergence with modern biology and medicine. Current Opinion in Biotechnology. 14(3):337-346.

[7] Li H, S. Huck WT. (2002), Polymers in nanotechnology. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 6(1):3-8.

[8] Van Hove MA. (2006), From surface science to nanotechnology. Catalysis Today.113(3- 4):133-140.

[9] Corbett J, McKeown PA, Peggs GN, Whatmore R. (2000), Nanotechnology: International Developments and Emerging Products. CIRP Annals - Manufacturing Technology. 49(2): 523-545.

[10] Sahoo SK, Parveen S, Panda JJ. (2007), The present and future of nanotechnology in human health care. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 3(1): 20-31.

[11] Koo OM, Rubinstein I, Onyuksel H. (2005), Role of nanotechnology in targeted drug delivery and imaging: a concise review. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 1(3):193-212.

[12] Copeland R.A. (2000), Enzymes a practical introduction to structure, mechanism, and data analysis. Wiley, New York. 385-390.

[13] Itoh K, Chiba T, Takahashi S, Ishii T, Igarashi K, Katoh Y, Oyake T, Hayashi N, Satoh, K, Hatayama I. (1997), An  Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase  II  detoxifying  enzyme genes through antioxidant response elements. Biochemical and biophysical research communications, 236: 313-322.

[14] Briggs, G. E.; Haldane, J. B. S. (1925), A note on the kinetics of enzyme action. Biochemical journal, 19:338.

[15] Carrea, G.; Ottolina, G.; Riva, S. (1995), Role of solvents in the control of enzyme selectivity in organic media. Trends in Biotechnology, 13:63-70.

[16] Najafpour, G. D. (2006), Biochemical engineering and biotechnology. Elsevier Science. Vol. 7 (9), pp. 1369-1376,

[17] Davies, G. J. Mackenzie, L. Varrot, A. Dauter, M. Brzozowski, A. M, Schlein, M. Withers, S. G. (1998), Snapshots along an enzymatic reaction coordinate: analysis of a retaining glycoside hydrolase. Biochemistry, 37: 11707-11713.

[18] Friden, C., Glutamic dehydrogenase. (1959),  III. The order of substrate addition in the enzymatic reaction. The Journal of biological chemistry, 234: 2891.

[19] Walsh, C., (1979), Enzymatic reaction mechanisms.

 [20] Illanes A., (2008), Enzyme biocatalysis principles and applications. Springer .

[21] Marangoni A.G. ( 2003), Enzymes Kinetics A Modern Approach. Wiley, New Jersey.

[22] Leskovac V. (2004), Comprehensive Enzyme Kinetics. Kluwer Academic Publishers. New York.

[23] Baker, B. R. ( 1975), Design of active-site-directed irreversible enzyme inhibitorse: the organic chemistry of the enzymic active-site. Vol. RE Krieger Pub. Co.

[24] Koshland Jr, D. (1960), The active site and enzyme action. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, 45-97.

[25] Tomkinson, A. E., Totty, N. F.,Ginsburg, M., Lindahl, T. (1991), Location of the active site for enzyme –adenylate formation in DNA ligases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88: 400.

[26] Shuler M.L., Kargi F. ( 2002), Bioprocess engineering- Basic concepts, Prentice-Hall , New Jersey.

[27] Balaco, V. M. and Malcata, F. X. (1998), Lipase catalyzed modification of milk fat, Biotechnol. Adv., 16, 309-341.

[28] Marangoni, A. G., (2002), Lipases: structure, function, and properties, in: Kuo, T. M. and Gardner, H. W. (eds),  New York, Basel: Marcel Dekker. Lipid Biotechnology, pp. 357-386

[29]  Paiva, A. L., Balaco, V. M. and Malcata, F. X., (2000), Kinetics and mechanisms of reactions catalyzed by immobilized lipases, Enzyme Microb. Technol., 27, 187-204

[30] Villeneuve, P., Muderhwa, J. M., Graille, J. and  Hass, M. J., (2000), Customizing lipases for biocatalysis: a survay of chemical, physical and molecular biological approaches, J. Mol. Catal. Part B: Enzym., 9, 113-148.

[31] Svendsen, A., (2000), lipase protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543, 223-238.

[32] Rigo, E., Ninow, J. L., Di Luccio, M., Oliveira, J. V., Polloni, A. E., Remonatto, D., Arbter, F., Vardanega, R., De Oliveira, D., Treichel, H., (2010),  Lipase production by solid fermentation of soybean meal with different supplements. LWT Food Sci. Technol., 43: 1132-1137.

[33] Damaso, M. C. T., Passianoto, M. A., Freitas, S. C., Freire, D. M. G., Lago, R. C. A., Couri, S., (2008),  Utilization of agroindustrial reidues for lipase production by solid-state fermentation. Brazillian Journal of Microbiology, 39: 676-681.

[34] Ellaiah, P., Prabhakar, T., Ramakrishna, B., Table, A., T., Adinarayana, K., (2004), Production of lipase by immobilized cells of Aspergillus niger. Process Biochemistry, 39: 525-528.

[35] Rodriguez, J., Mateos, J., Nungaray, J., Gonzalez, V., Bhagnagar, T., Roussos, S., Cordova, J., Baratti, J., (2006),  Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopuse homothallicus cultured in solid state fermentation. Process Biochemistry, 41: 2264-2269.

[36] Gombert, A.K., Pinto, A. L., Castilho, L. R., Freire, D. M. G., (1999),  Lipase production by "Penicillium restrictum" in solide-state fermentation using babassu oil cake as substrate. Process biochemistry, 35: 85-90.

[37] Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U. C., (2001), Production, purification, characterization, and applications of lipases, Biotechnol. Adv., 19, 627-662.

[38] Ransac, C., Ivanova, M., Panaiotov, I. and Verger, R., (1999), Monolayer techniques for studying lipase kinetics, in: Dollittle, M. and Reue, K. (eds),  Methods in molecular biology, Totowa, New Jersey: Humana Press. Vol 109, pp. 279-301.

[39] Verger, R., Mieras, M. C. H.and de Haas, G. H., (1973), Action of phospholipid A at interfaces, J. Mol. Biol., 284, 4023-4034.

[40] Hasan, F., Shah, A. A., Hameed, A ,. ( 2009),  Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review. Biotechnology Advances, 27: 782-798.

[41] Messing, R. A., 1985, Immobilization techniques enzymes, in: Cooney, C. L. and Humphrey, A. M. (eds), Comprehnsive biotechnology, Vol. 2, pp.191-201, Oxford, New York, Toronto, Sydney, Francfurt: Pergamon  Press.

[42] Walsh, G., (2002), Proteins:  biochemistry and biotechnology, England: John Wiley and Sons. pp.402-405.

[43] Bickerstaff G.F., (1997),Immobilization of enzymes and cells. Human Press Inc, New Jersey .

 [44] Sagheer, F.A.A, M., Al-Sughayer, S. Muslim and M. Elsabee, (2009), Extraction and characterization of chitin and chitosan from marine sources in  Arabian Gulf. Carbohydrate Polymers: 2(77): 410-419.

[45] Choorit, W., W. Potthonamanee and S. Manurakchinakorn, (2008), Use of response surface method for the determination of demineralization efficiency in fermented shrimp shells. Bioresource technology, 14(99): 6168-6173.

[46] Kim, W. J., W.G, Lee, K. Theodore and H.N Chang, (2001), Optimization of culture condition and continuous production of chitosan by the fungi, Absidia coerulea. Biotechnology and Bioprocess Engineering, I (6): 6-10.

[47] Rinaudo, M, (2006), Chitin and chitosan properties and applications. Progress in Polymer science, 7(31): 532-603.

[48] Shirai, K, I. Guerrero, S. Huerta, G. Saucedo, A. Castillo, R. Obdulia Gonzalez and G.M. Hall,( 2001), Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation Enzyme and microbial technology, 4-5(28) : 446-452.

[49] Skjak-brack, G., T. Anthonsen and P. A., Sandford, (1989), Chitin and chitosan: sources, chemistry, biochemistry, physical properties, and applications. Kluwer Academic Pub.

[50] Shahidi, F., J.K.V. Arachchi and Y.J., Jeon, (1999) Food applications of chitin and chitosans Trends in Food Science & Technology, 2(10): 37-51.

[51] Sag Y, Aktay Y. (2002), Kinetic studies on sorption of Cr(VI) and Cu(II) ions by chitin, chitosan and Rhizopus arrhizus. Biochemical Engineering Journal. 12(2):143-153.

[52] Uzun I. (2006), Kinetics of the adsorption of reactive dyes by chitosan. Dyes and Pigments. 70(2):76-83.

[53] Denkbas. E. B., Kilicay, Birlikseven, C., and Ozturk, E.(2002), React. Funct.Polym. 50, 225-232.

[54] Selmer-Olsen, E., Ratnaweera, H.C., and Pehrson, R.(1996) , Water Sci. Technol. 34,33-40.

[55] Kucera, J. (2004), J. Chromatogr. B 808, 69-73.

 [56] Chiou, S.H. and Wu, W.T. (2004), Biomaterials 25, 197-204.

[57] Mi, F.L, Kuan, C. Y., Shyu, S. S., Lee, S. T., and Change, S. F. (2000), Carbohydr. Polym. 41,389-396.

[58] Aranaz., I.M., MengibaR. HarrisI. PanosB. MirallesN. AcostaG, Galed, et al., (2009), Functional characterization and chitosan. Current Chemical Biology, 2(3): 203-230.

[59] Shahidi F, Arachchi JKV, Jeon Y-J. (1999), Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Science & Technology. 10(2):37-51.

[60] Cárdenas G, Orlando P, Edelio T. (2001), Synthesis and applications of chitosan mercaptanes as heavy metal reten on agent. Internasional Journal of Biological Macromolecules. 28(2):167-174.

[61] Khor E, Lim LY. (2003), Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24(13):2339-2349.

[62] Crini G, Badot P-M. (2008), Application of chitosan, a natural aminopolysaccharide, for dye removal from aqueous solutions by adsorption processes using batch studies: A review of recent literature. Progress in Polymer Science. 33(4):399-447.

[63] Krajewska B. (2004), Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme and Microbial Technology. 35(2-3):126-139.

[64] Senel S, McClure SJ. 2004, Potential applications of chitosan in veterinary medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 56(10):1467-1480.

[65] Rinaudo M. (2006), Chitin and chitosan Properties and applications. Progress in Polymer Science. 31(7):603-632.

[66] Dodane V, Vilivalam VD. (1998), Pharmaceutical applications of chitosan. Pharmaceutical Science & Technology Today. 1(6):246-253.

[67] Lorenzo-Lamosa ML, Remuñán-López C, Vila-Jato JL, Alonso MJ. (1998), Design of microencapsulated chitosan microspheres for colonic drug delivery. Journal of Controlled Release. 52(1-2):109-118.

[68] Okamoto Y, Yano R, Miyatake K, Tomohiro I, Shigemasa Y, Minami S. (2003), Effects of chitin and chitosan on blood coagulation. Carbohydrate Polymers. 53(3):337-342.

[69] Ravi Kumar MNV. (2000), A review of chitin and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers. 46(1):1-27.

[70] El-Tahlawy KF, El-Rafie SM, Aly AS. (2006), Preparation and application of chitosan/poly(methacrylic acid) gra  copolymer. Carbohydrate Polymers. 66(2):176-183.

[71] Nitrogenases, A. (1995), Nitrogenases And Hydrogenases In Cyanobacteria Kluwer Academic Pub.

[72] Flannery, E. L., Mody, L., Mobley, H. L. T., (2009), Identification of a modular pathogenicity island that is widespread among urease-producing uropathogens and shares features with a diverse group of mobile elements. Infection and immunity, 20: 4877.

[73] Hou, C. T., (2002), Industrial uses of lipases, in: Kuo, T. M. and Gardner, H. W. (eds),   Lipid Biotechnology, pp. 387-397, New York, Basel: Marcel Dekker.

 [74] Kurita, K., (1998), Chemistry and application of chitin and chitosan, Polymer Degradation and Stability, 1-3(59): 117-120.

[75] Ogawa K, Yui T, Okuyama K. (2004), Three D structures of chitosan. International Journal of Biological Macromolecules. 34(1-2):1-8.

[76]  Kucera J, (2004), Fungal mycelium-the source of chitosan for chromatography, Chromatogr  B,  808, 69-73.

[77]  Oyrton AC, Monteiro Jr, Airoldi C, (1999), Some studies of  cross linking chiotosan-glutaraldehyde interaction in a homogeneous system, Int J Biol Macromol, 26,119-28.

[78] Mi FL, Kuan CY, Shyu SS, Lee ST, Chang SF, (2000), The study of gelation kinetics and chain-relaxation  properties of glutaraldehyde cross-linked chitosan gel and their effects on microspheres preparation  and  drug release, Carbohydr Polym, 41, 389-96.

[79] Selmer-Olsen E, Ratnaweera HC, pehrson R, (1996), A novel treatment process for dairy wastewater with chitosan produced from shrimpshell waste  Water Sci Technol , 34, 33-40.

[80] Serra, E., Mayoral, A., Sakamoto, Y., Blanco, R.M., Diaz, I., (2008), Immobilization of lipase in ordered mesoporous materials: effect of textural and structural parameters. Microporous and Mesoporous Materials 114, 201–213.

[81] Gao S, Wang Y, Diao X, Luo G, Dai Y, (2010), Effect of  pore diameter and cross- linking method on the immobilization efficiency of candida rugosa lipase in SAB-15 , bioresource technology, 101, 3830-3837.

[82] Tang Z, Qian J, Shi L, (2007) , Preparation of Chitosan Nanoparticles as Carrier for Immobilized Enzyme  Biochemistry  and  Biotechnology , 136,77-96.

[83] Tang Z  , Shi L, Qian Q , (2007) ,  Characterizations of Immobilized Neutral Lipase on Chitosan nano-particles , Materials Letter, 61, 37-40.

 [84] Zhao L , Shi L, Zhang Z, Chen J, Shi D, Yang J, Tang Z, (2011), Preparation and Application of Chitosan Nanoparticles  and  Nanofibers,  Brazilian Journal of Chemical Engineering , 28 , 353-362.

[85] Biro E , Nemeth A , Sisak C , Feczko T, and Gyenis J , (2008),  Preparation of chitosan particles suitable for enzyme immobilization,  Biochem. Biophys. Methods , 70 , 1240-1246.

[86] Tang Z, Shi L, Qian J, ( 2007),  Neutral lipase from aqueouse solution on chitosan nano-particle Biochemical Engineering Journal, 34, 217-223.

[87] Pandey, A., Soccol, C. R., Nigam, P., Soccol, V. T., (2000),  Biotechnological potential of agro-industrial residues. I: sugarcane bagasse . Bioresource technology, 74: 69-80.

[88] Raghavarao, K., Ranganathan, T., Karanth, N., (2003), Some engineering aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13: 127-135.

[89] Stuart, D, Mitchell, D. Johns, M., Litster, J., (1999),  Solid state fermentation in rotating drum bioreactors: Operating variables affect performance through their effects on transport phenomena . Biotechnology and bioengineering, 63: 383-391.

[90] Kim, M; Ham,H; Oh, S; Park, H; Chang, S; Choi, S., (2006), Immobilization of Mocur Javanicus Lipase on Effectively Functionalized Silica Nanoparticles . Journal of molecular catalysis B: Enzymatic , 39 : 62-68