دانلود پروژه دانشجویی بررسی امکان تولید گیاهان هاپلوئید از طریق کشت میکروسپور در گیاه کلزا

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته مهندسی کشاورزی-اصلاح نباتات(M.Sc.)     اردیبهشت 1385

                                                                                                                                          چکیده:

  بوجود آمده است. B.oleracea وB.rapa های کلزا گیاهی آلو تترا پلوئیدست.که از تلاقی بین گونه                

یکی از روشهای ٬ کشت میکروسپور کلزا و سپس باززایی جنینهای بدست آمده از کشت میکروسپور می باشد. دراین تحقیق که در سازمان انرژی اتمی اجرا شد مشخص گردید که استقاده از تیمارهای مختلف٬ در میزان باززایی جنین ها موثر است. در آزمایش اول اثرتراکمهای مختلف ( ml٬20000 ml30000 وml 40000 ) میکروسپور بر روی جنین زایی میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که هر سه تراکم در سطح 1%با هم اختلاف معنی داری دارند . تراکمml 40000 میکروسپور (باتولید 33/1031% جنین) بالاترین و تراکمml 20000 میکروسپور ( با تولید 72/137% جنین) پایین ترین گروه میزان جنین زایی را  داشتند.درحالیکه تراکمml 30000 میکروسپوربا52/413جنین در گروه حدواسط  قرارگرفت.درآزمایش دیگراثراندازه های مختلف جنین بر روی صفات باززایی جنینهای حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال موردمطالعه قرارگرفت٬ که این صفات عبارت بودنداز: 1.تولیدنوساقه:که درجنینهای بزرگتر از 6میلیمتر دارای بیشترین مقدارست. 2.کالزایی برروی لپه:که اندازه های مختلف جنین در سطح 1% و 5% اختلاف معنی داری با هم ندارند. 3.تولیدبرگ:که در جنین های بزرگتر از 6 میلیمتردارای بیشترین مقدارست. 4.تولیدجوانه های نابجا:که درجنینهای 5 تا6 میلیمتری دارای بیشترین مقدارست. 5.ریشه زایی:که در سطح 1%دارای اختلاف معنی داری میباشد . در آزمایش دیگر مطالعه اثر استفاده  از  کاغذ  صافی در  میزان  طول  ریشه  ٬ ارتفاع گیاهچه ودرصد تولید گیاهچه های نرمال در دو رقم گلوبال و آپشن  مورد مطالعه قرار گرفت . نتایج حاصل از این آزمایش در میزان طول ریشه  ٬ارتفاع گیاهچه وتولید گیاهان نرمال بیانگر آنست که در رقم گلوبال در دو حالت با کاغذ و بدون کاغذ فیلتر نسبت به  رقم  آپشن  دارای  طول ریشه و ارتفاع گیاهچه بیشتری بودند . ولی در حالت اثر متقابل نوع رقم  با کاغذ  فیلتر دارای اختلاف معنی داری  نبودند در آزمایش دیگر اثر  استفاده  از شوک  سرمایی بر  روی  درصد تشکیل  گیاهچه های طبیعی در دو رقم گلوبال  و آپشن مورد مطالعه قرار گرفت . که در  این آزمایش مشاهده شد که تشکیل گیاهچه های طبیعی در دمای  4 درجه به مدت 10 روز در دو رقم گلوبال و آپشن با95/55% دارای بیشترین مقدار تولید بودند.                                           

کلمات کلیدی: کلزا٬کشت میکروسپور٬کاغذ فیلتر و باززایی گیاه نرمال                   

مقدمه   :

گیاه کلزا مهمترین گونه زراعی جنس براسیکا (Brassica) میباشد. و ویژگیهای خاص این گیاه یعنی قابلیت کشت در نقاط مختلف ، در صد بالای روغن آن ، کیفیت مطلوب روغن ، کاربرد روغن آن در صنایع نساجی و پلاستیک و نیز استفاده از کنجاله آن در تغذیه دام سبب شده است که توسعه کشت این گیاه بعنوان نقطه امیدی جهت تامین روغن خام مورد نیاز کشور و رهائی از وابستگی بشمار رود .بطوریکه در حال حاضر کلزا نقطه ثقل طرحهای افزایش تولید دانه های روغنی محسوب میگردد. دانه‎های روغنی قسمت مهمی از تولید محصولات کشاورزی را شامل می‎شوند، چون علاوه بر مصارف صنعتی از لحاظ تغذیه نیز اهمیت بسزایی دارند. سطح زیر کشت دانه‌های روغنی در سال  1383  (بجز کنجد که در سیستم روغن کشی وارد نمی‌شود) 319 هزار هکتار و محصول تولید شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده ‌است. مصرف روغن نباتی در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از تولید داخل تامین شده ‌است ( بی نام ، 1382 ).  کلزا به عنوان یک گیاه روغنی با بیش از 40% روغن در دانه از گیاهان مهم جهت توسعه کشت نباتات روغنی وتولید روغن نباتی در ایران است. کلزا با نام علمی Brassica napus  و نام انگلیسی Rapeseed گیاهی از تیره Brassicacea  ( چلیپائیان یا شب بو ) می‎باشد که پس از سویا و نخل روغنی مقام سوم را در تأمین روغن نباتی جهان به خود اختصاص داده است که در حدود 7/14% کل تولید روغن نباتی جهان را تأمین می‎کند. این گیاه در برابر خشکی و سرما مقاوم بوده و به دلیل سازگاری، دامنه کشت وسیعی دارد  ( دهشیری 1378 ). روشهای سنتی (کلاسیک) اصلاح نباتات از دیر باز برای تولید گیاهان زراعی برتر مورد استفاده قرار میگرفته است که مبتنی بر ایجاد تغییر در ساختار ژنتیکی گیاه کامل در جهت هدف خاصی با استفاده از تلاقیهای بین جنسی ودرون جنسی بوده است.

روشهاییکه جهت اصلاح گیاهان خود گشن بکار گرفته میشوند٬ عمدتا روشهای گزینش (Selection) و یا دورگ گیری (Hybridization) است که در مورد اول از تنوع ژنتیکی موجود در توده های طبیعی و بومی استفاده شده و واریته های اصلاح شده ای که نسبت به جامعه اولیه برتری هائی از نظر کمی و کیفی دارند بوجود می آیند. شانس موفقیت در این روش نسبتا کم است زیرا به غنای ژنتیکی توده های محلی بستگی دارد که امروزه رو به کاهش بوده و کمتر قابل دسترسی است. در مقابل روشهای مبتنی بر تلاقی به اصلاحگر این امکان را میدهد که بطور هدفدار صفات مطلوب واریته های مختلف را با یکدیگر تلفیق نماید(Poehlman and Mitton , 2003).

یک پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گیری تا آماده شدن واریته جهت کشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف می شود لذا امروزه متخصصین اصلاح نباتات به دنبال روشهائی هستند که بتوان این مدت زمان را به حداقل ممکن رسانید تا در وقت و هزینه های سنگین برنامه های اصلاح نباتات صرفه جوئی شود. برای این کار سعی بر اینست که بتوان با ایجاد تغییرات ژنتیکی در سطح سلول ، زمان لازم برای تهیه ارقام پر محصول با کیفیت بالا و مقاوم به بیماری و یا تنشهای محیطی را در برنامه های به نژادی کوتاه کرد(اصلانی و همکاران ، 1381). 

کلزا گیاهی‎ خودگشن‎-‎ دگرگشن می‎باشد ودرصد دگرگشنی آن در ارقام مختلف بین 33%-22% گزارش شده است ( شهیدی و فروزان ، 1376 ). این گیاه آلوتتراپلویید (38=x4=n 2) می‎باشد.روشهای سنتی اصلاح نباتات در چند دهه اخیر نقش بسیار مهمی در اصلاح عملکرد و کیفیت کلزا داشته اند که از میان این روشها می توان به روش انتخاب توده ای[1] و گزینش شجره ای[2]  اشاره کرد. از معایب این روشها طولانی بودن دوره آنها می باشد. امروزه متخصصین اصلاح نباتات به دنبال روشهای دیگری هستند که بتوانند این مدت را به حداقل ممکن برسانند تا در وقت و هزینه های سنگین برنامه های اصلاح نباتات صرفه جویی شود.  یکی از این روشها اصلاح از طریق سیستم دابل هاپلوئیدی[3] می باشد، که به عنوان وسیله ای برای ترکیب صفات یک تلاقی می تواند مکمل روش شجره ای باشد. اهمیت استفاده از گیاهان هاپلوئید در برنامه های اصلاح نباتات از مدتها پیش برای دانشمندان مسلم گردیده است و یکی از موضوعات مهم تحقیقاتی در این زمینه، تولید لاینهای هموزیگوس جهت تولید گیاهان هیبرید در گونه های خودناسازگار می باشد. با تولید لاینهای کاملاً هموزیگوت در این روش 5-3 سال در زمان برنامه های اصلاحی صرفه جویی می شود. سیستم دابل هاپلوئیدی در صورتی موفق است که به توان گیاهان هاپلوئید ودابل هاپلوئید تولید کرد، بدین منظور قبل از استفاده از این سیستم آزمایشاتی را در جهت  بهینه سازی گیاهان می بایست انجام داد. روشهای متعددی جهت تولید گیاهان هاپلوئید و به دنبال آن گیاهان دابل هاپلوئید وجود دارد که یکی از این روشها آندروژنز[4] می باشد.

آندروژنز به دو روش انجام می شود : الف کشت بساک[5] ب کشت میکروسپور[6] . کشت میکروسپور اخیراً به لحاظ مزایای آن بر کشت بساک، مورد توجه قرار گرفته است. در این روش امکان تولید تعداد زیادی گیاهان هاپلوئید وجود دارد. تولید سریع لاینهای خالص از میکروسپورهای جدا شده، مهمترین ویژگی این روش در برنامه‌های اصلاحی می باشد. همچنین با توجه به فراوانی بالای تولید گیاه از کشت میکروسپور و نیز سهولت انتقال ژن ، کشت میکروسپور ، کارآمدترین و بهترین اندام هدف در انتقال ژن به شمار می آید و دانشمندان امیدوارند که در آینده ای نزدیک از  این روش به عنوان یک روش متدوال در مهندسی ژنتیک استفاده نمایند. میکروسپورهای گیاهان F1 می توانند لاینهای دابل هاپلوئید بسیاری تولید کنند تا برای ترکیب مطلوبی از صفات گزینش شوند. لاینهای انتخابی، کاملاً خالص هستند و از نظر یکنواختی و پایداری برای به نژادگران مشکلات کمتری به دنبال دارند .(Mohan Jain et al., 1996)  تولید رویانهای هاپلوئید و به دنبال آن تولید گیاهان دی هاپلوئید در کلزا از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد . در طبیعت تولید گیاهان هاپلوئید به صورت خود‎به‎خودی، درگونه‏های Brassica در فراوانی بسیار  پایین  (حدود 4/19-05/0 در هزار گیاه ) اتفاق می‎افتد ( Banga and Labana , 2003 ) . اما به هر جهت بهره وری واقعی از هاپلوئیدهای ردهBrassica   با کشف روشهای القاء رویان از بساکها و میکروسپورهای جدا شده در شرایط درون شیشه ای آغاز گردید . گیاهان هاپلوئید زیادی بطور رایج توسط کشت بساک یا میکروسپورهای جدا شده تولید می شوند، اگرچه تنوع قابل ملاحظه ای بین گونه‎ها ، واریته‎ها و ارقام مختلف وجود دارد ، اما تکنیکهای کشت میکروسپور جدا شده و کشت بساک به طور موفقیت‎آمیزی برای اکثرگونه‎ها و واریته‎های تجاری رده Brassica استفاده شده است و در سالهای اخیر پیشرفتهای چشمگیری در این زمینه بدست آمده است ، به طوریکه ‎ رویان زایی میکروسپور در B. napus یکی از کامل‎ترین سیستم‎ها برای تولید گیاه در شرایط درون شیشه ای[7] است((Burnett  et al., 1992  .

تکنیک باززایی گیاه از رویانهای حاصل از کشت میکروسپور برای اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک ضروری است اما گزارش شده است که اکثر رویانها به گیاهچه تبدیل نمی‌شوند و به صورت غیر طبیعی باززایی می‌شوند یا اینکه رویانهای ثانوی را تشکیل می‌دهند. ( Takahata,1997 )   همچنین عدم باززایی یا باززایی بسیار اندک رویانهای هاپلوئید به خصوص در کشت پرچم نیز گزارش گردیده است      ( Bruins and Snijder, 1995 ) .  در ایران ، برای اولین مرتبه آزمایشاتی در زمینه رویان زایی و باززایی در قالب پایان‎نامه کارشناسی‎ارشد در دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس انجام شد ‎‎که موفقیت چشمگیری نیز حاصل شد. در اولین  تحقیق ( باقری ، 1379 )، سه رقم بهاره  ( F704, Global, Maluka ) وسه رقم پاییزه کلزا  (Ceres  Slmo46, Bounty, ) از لحاظ پاسخ به کشت میکروسپور مورد ارزیابی قرار گرفتند که در دو آزمایش هیچ رویانی بدست نیامد، اما در آزمایش آخر، از 36 پتری‎دیش کشت شده حدود 20 رویان حاصل شد و رقم Bounty در رویان زایی و  باززایی گیاه، به عنوان بهترین ژنوتیپ شناخته شد. در تحقیق دیگر ( خنجی ، 1380 )، پاسخ به کشت میکروسپورهای جدا شده کلزا در یک رقم بهاره ( Global ) و دو رقم پاییزه ( Okapi و  Colvert )  مورد بررسی قرار گرفت. رقم Global  به عنوان بهترین رقم در بین ارقام استفاده شده از نظر پاسخ دهی به کشت میکروسپور کلزا شناخته شد و در هر پتری‎دیش کشت شده، حدود 22% رویان بدست آمد. در تحقیق دیگر ( عبدالهی ، 1381 )، اثر تراکم، اثر شوک حرارتی و اثر تعویض محیط کشت بر روی رویان زایی، واثر اندازه های مختلف رویان بر روی باززایی گیاه در رقم بهاره کلزا  ( Global ) مطالعه شد. در این تحقیق، بالاترین میزان رویان زایی در تراکم 40000 میکروسپور در هر میلی‌لیتر محیط کشت بدست آمد. تعویض محیط کشت، میزان رویان زایی میکروسپورهای کلزا را در تراکم های مختلف میکروسپور افزایش داد و رویانهای5  میلیمتری، بهترین باززایی را نشان دادند. در تحقیق دیگر ( حبیبی ، 1382 )، اثر حجمهای مختلف محیط کشت بر روی رویان زایی و اثر شوک حرارتی و زغال فعال بر روی باززایی گیاه رقم بهاره کلزا ( PF )  مطالعه شد. در این تحقیق، بالاترین میزان رویان ‌زایی در پتری‌دیشهایی با قطر cm 10 و حجمهای محیط کشت ml 5/12 و ml 10 بدست آمد. همچنین مقایسه میانگین اثر غلظتهای مختلف زغال فعال در محیط کشت باززایی بر روی درصد تشکیل گیاهچه‌های طبیعی نشان ‌داد، که غلظتهای مختلف زغال فعال در سطح 5% با هم اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهند، بطوریکه میزان l-1 g 125/0 زغال فعال با تولید 40% گیاهچه کاملاً طبیعی، در گروه a قرار گرفت . 

در این تحقیق سعی بر این است تا شرایط برای  باززایی گیاهان حاصل از رویانهای بدست آمده از میکروسپورها بهینه ‎سازی شود، برای این منظور اثرات مختلف شوکهای سرمائی و نیز آبگیری رویانها و اثر استفاده از کاغذ صافی مورد آزمایش و مطالعه قرار گرفت ،  تیمار آبگیری رویانها  با تسریع در بلوغ رویانها ( Wang et al., 2002 ) ، درصد باززایی گیاهان را افزایش می دهند. در ارتباط با مطالعه اثرشوکهای سرمائی، سرمای هوا نیز می تواند بر روی تبدیل رویان به گیاه موثر باشد.

  در هنگام انجام این تحقیق سوالهائی از قبیل سوالات ذیل مطرح بودندکه پاسخ به آنها به تفصیل در قسمت مربوطه آورده شده است .                                                                                                                                          

1- آیا اعمال شوکهای سرمائی  می‎تواند اثر معنی داری بردرصد باززایی گیاهان کلزای مورد مطالعه داشته باشد ؟

2- آیا استفاده از کاغذ صافی  می‎تواند اثر معنی داری روی درصد باززایی گیاهان کلزای مورد مطالعه داشته باشد؟

3- آیا اثر تراکمهای مختلف میکروسپورها بر روی جنین زائی میکروسپورهای کلزا اثر معنی داری دارد؟

4- آیا باززائی گیاه سبز در جنین هائی با اندازه های مختلف حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا با  هم تفاوت معنی داری دارند؟

منابع مورد استفاده

باقری، ه (1379). بررسی پاسخ به کشت میکروسپورهای ایزوله در تعدادی از ژنوتیپهای کلزا. پایان نامه کارشناسی ارشد دانشگاه تربیت مدرس، ، 84 ص. 

     . میزان تولید دانه‌های روغنی چهارشنبه۲۲ مرداد ۱۳۸۲ - سال یازدهم -  شماره  ۳۱۳۵              1382 ) بی نام(

حبیبی، ب)1382). بهینه سازی پاسخ به کشت میکروسپورهای ایزوله کلزا(Brassica napus L.). پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس123 ص

دهشیری، ع (1378). زراعت کلزا. وزارت کشاورزی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، معاونت ترویج، 63 ص.

شهیدی، ا و  فروزان، ک (1376). کلزا. شرکت سهامی خاص توسعه کشت دانه های روغنی،50 ص.

عبدالهی، م (1381) . اثر برخی فاکتورها روی تولید جنین و باززایی گیاه در کشت میکروسپورهای ایزوله کلزا napus L.).   (Brassica . پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، 120 ص

  عزیزی، م، سلطانی، ا و خاوری خراسانی، س (1378). کلزا، انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد، 230 ص.

 نوری قنبلانی، ق (1371). تجربیاتی در زمینه کشت بافتهای گیاهی. (تألیف جان. اچ. دادز، لورین. و.  رابرتز). انتشارات دانشگاه تبریز.

Albrecht, S. , Mollers, C. and Robbelen, G. ( 1995 ). Selection in vitro for erucic acid content in segregation populations of microspore derived embryoids of Brassica napus. Plant breeding, 114 : 210 – 214.

Anonymous,(2003). Cultivated lines produced by doubled haploidy . http// www.scri.sari.ac.uk / assoc / COST851 / dhtable.com .

Bagniewska, Z. A. , Cegielska, T. T. and Zenkteler, M. (2001). Organogenesis initiation and plant regenaration from hypocotyls and cotyledons of androgenic embryos of Brassica napus L. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 43 :51 -57 .

Baillie, A. M. K. , Epp , D. J. , Hutcheson, D. and Keller, W. A. (1992). In vitro culture of isolated microspore and regeneration of plants in Brassica campestris. Plant Cell Reports, 11:234-237.

Banga, S. S. and Labana, K. S. (2003). Spontaneous haploidy in Brassica napus. Cruciferae News , 11: 54-55.

Beversdorf, W. D. , Erickson, L. R. and Grant , I. (2002). Hybridization process utilizing a combination of cytoplasmic male sterility and herbicide tolerance. U. S. Patent and Trademark Office, 43: 511.

Bohanic, B. , Neskovic, M. and Vujicic, R. (1993). Anther culture and androgenic plant regeneration in buck wheat (Fagopyrum esculentum monech). Plant cell, Tissue and Organ culture, 35: 259-266.

Boutilier, K. A. , Gines, M. J. , DeMoor, J. M., Huang, B. , Baszczynski, C. L., Iyer,V. N. and Miki, B. L. (1994). _Expression of the BnmNAP subfamily of napin genes coincides with the induction of Brassica microspore embryogenesis. Plant Molecular Biology, 26: 1711-1723.

Bruins, M. B. M. and Snijders, C. H. A. (1995). Inheritance of anther culture derived green plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 43: 13-19.

Burbalis, N., Kuusiene , S. and Sliesaravicius, A. (2000). Plant regeneration in androgenic culture of spring rapeseed (Brassica napus L. ). Sodininkyste ir Darzinikyste, 19 : 419 – 426.

Burnett, L., Yarrow, S. and Huang, B. (1992). Embryogenesis and plant regeneration from isolated microspores of Brassica rapa. Plant Cell Reports, 11:215-218.

Carlos, J. and Dias, S. (1999). Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis. Euphtica,108: 65-69.

Chan , J. K.  Pauls, P. K.(unpublished). Studies of gene _expression, including small G proteins during androgenesis in Brassica napus microspore culture. university of guelph, department of plant agriculture.

Charne, D. G. and Beversdorf, W. D. (2003). Improving microspore culture as a rapeseed breeding tool: the use of auxines and cytokinin in an induction medium. Canadian Journal of Botany, 66 : 1671 -1675 .

       Chuong, P. V., Deslauriers, C., Ott, L. S. and Beversdorf, W. D. (1988). Effects of donor genotype and sampling on microspore culture of Brassica napus. Canadian.. Journal of Botany, 66: 1653-1657.

Cordwener, J. H. C., Busink, R., Trass, J. A., Custers, J. B. M., Dons, H. J. M. and Van Lookern Campange, M. M. (1994). Induction of microspore embryogenesis in Brassica napus L. is accomplished by specific change in protein synthesis. Planata, 195: 50-56.

Custers, J. B. M., Cordwener, J. H. G., Van Lammeren, A. A. M., Dons, J. J. M. and Van Lookern Campagne, M. M. (1994). Regulation of inductive phase of microspore embryogenesis in Brassica napus. Abstract of ISHS Symposium on Brassica, Ninth Crucifer Genetic Workshop, Lisbon, Portugal, pp . 36 .

Demarch, G., McGregor, D. I. and Seguin-swartz, G. (1989). Glucosinolate content of maturing pods and seeds of high and low glucosinolate summer rape. Canadian Journal of Plant Science. 69 : 929 -932.

Dirk , B., Edward ,C. and Richard, P. (2002). The role of gibberellins in embryo axis development. Experimental Botany , 53: 1747-1751.

Downey, R. K. And Robbelem, G. (1989). Brassica species. Oil Crops of the World. McGraw-Hill, New York. pp .339 -362 .

Downey, R. K., Stringam, G. R., McGregor, D. I. and Stefansson, B. R. (1975). Breeding rapeseed and mustard crops. Western Cooperative Fertilizers, Calgary, Alberta, Canada, pp . 157 -183 .

Dunwell , J. M. (1996). Microspore culture. In: Mohan Jain, Sopory, S. K. and Veilleux, R. E. (eds ), In vitro Haploid production in Higher plants. Vol.1.Kluwer Academic Publishers. The Netherlands. pp. 205 -216 .

Dunwell , J. M. and Cornish, M. (1985). Influence of preculture variables on microspore embryo production in Brassica napus ssp.oliefera. Annual of Botany, 56 : 281 -289 .

Fan , Z., Armstrong, K. C. and Keller, W. A. (1988). Development of microspores in vivo and in vitro in Brassica napus l. Protoplasma. 147: 191-199.

Ferrie , A. M. R. and Keller, W. A. (1995). Microspore culture. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture Fundamental Methods, eds. Gamborg, O. L. and Philips, G. C., pp. 155-164. Springer-Verlag, Berlin, Germany.

Fletcher, R., Coventry, J. and Kott. L. S. (1998). Doubled Haploid Technology for Spring and Winter Brassica napus, Technical Bulletin, OAC Publication, Canada .

Foroughi-Wehr. B. and keller, F. J. (1990). In vitro microspore reaction of different German cultivars. Theoretical and Apllied Genetics, 79 : 77 -80 .

Furusho, M., Suenaga, K. and Nakajima, K. (1991). Production of haploid barely plants from barely × maize and barely × Italian rye grass crosses. Japan Journal of Breeding, 41: 175-179.

Gland, A. , Lichter, R. and Schweiger, H. G. (1988 ). Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore culture of Brassica napus. Plant Physiology, 132 : 613 -617 .

Grami, B., Baker, R. J. and Stefanson, B. R. (1977). Genetics of protein and oil content in summer rape: heritability, number of effective factors, and correlations. Canadian Journal of Plant Science. 57 : 937 -943.

Grubor, I. K. (1998). A novel approach to microspore embryogenesis in Brassica napus. Ph.D. Thesis, University of Suskatchewan, Saskaton, Canada.

Hamaoka, Y., Sato, S. and Iwai, S. (1991). Effect of sugars, amino acids and embryogenesis in pollen culture of Brassica compestris. Abstrct of XII Plant Tissue Culture Confrence. pp. 222 .Nagoya, Japan .

Hansen, M. and Svinnset, K. (1993). Microspore culture of swede and the effects of fresh and conditional medium. Plant Cell Report, 12: 496-500.

Henry, Y. and De Buyser, J. (1995). Agronomic performance of doubled haploid lines. Plant Breeding, 33: 71-79.

Huang, B., Bird, S., Kemble, R., Miki, B. and Keller, W. (1991). Plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus : Effect of embryo age, culture temperature, osmotic pressure and abscisic acid. In vitro cell develop Biollogy 27 : 28 -31.

Huang, B., Bird, S., Kemble, R., Simmonds, D., Keller, W. A. and Miki, B. (2003). Effects of culture density, conditioned medium and feeder cultures on microspore embryogenesis in Brassica napus. Plant Cell Reports, 8: 59

Huang,B.,Swanson, E.B.,  Baszcynski,  C.  L.,  Macrae,  W.  D.,  Bardopur,  E.,  Armavil,  V.,  Wohe, L., Arnoldo,  M.,  Rozakis,  S.,  Westecott,  M.,  Keats,  R. F. and Kemble,  R.,  (2002).  Application  of  microspore  culture to canola improvement. In : the proceeding of  8th  international  Rapseed Congres,  rd., McGregor , D.L.,pp:298-302.Saskatoon, Canada4-597.

Jensen, C. G. (2004). Production haploid plants by chromosome elimination. In: Cell and Tissue Culture Techniques for Cereal Crop Improvement, pp. 55-79. International Rice Research Institue, Manila, Philipines.

Kasha, K. J. (2003). Haploid in Higher Plants : Advances and potential (proceeding of the 1st Internation Symposium ). University of Guelph, Canada .

        Kawana , H. and Ohkawa, Y. (1992). Methods for high frequency leafing of microspoe derived embryos. Japan J. Breed, 42: 70-71.

        Keller, W. A., Arnison, P. G. and Cardy, B. K. (2002). Haploids from gametophytic cells recent development and future prospects. In: Plant Tissue and Cell Culture, Green, C.E., Somers, D.A., Nackett W.P. and Biesbore, D .D. (Ed). pp:233-241. Allan R. Liss, New York, USA.

        Keller ,  W.A.,  and  Armstrong,  K.C.  (1999) .  Sthmulation of embryogenesis and haploid production in Brassica  Campesteris  anther  cultures by elevated temperature treatments.Theoretical and Applied Genetics ,55:65-69        

Kirk, J. T. O. And Hurlestone, K. C. (2004). Variation and inheritance of Brassica juncea. Pflanzenzuchtung. 90 : 331 -338.

Kott, L. S., Polsoni, L. and Beversdorf, W. H. (1987). Cytological aspects of isolated microspore culture of Brassica napus. Can J Bot, 66: 1658-1664 .

       Kott, L. S.(1998). Application of doubled haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus.Crop Science, 10: 69-74.

Kott, L.S. and Beversdorf, W. D. (1990). Enhanced plant regeneration from microspore derived embryos of Brassica napus by chilling, partial desiccation and age selection. Plant Cell Tissue Culture 23 : 187 -192 .

Kuginuki, Y., Nakamura, K., Hida, K. and Yoshikawa, H. (1997). Varietal differences in embryogenic and regenerative ability in microspore culture of Chinese cabbag (Brassica rapa L. ssp. Pekinensis). Breed Sci 47: 341-346.

Kumar De, K. (2003). An Introduction to Plant Tissue Culture. New Central Book Agency LTD. P :185 .

Li, X. and Guan, C. (2003). Studies of microspore culture and doubled haploid breeding on rapeseed: plant regeneration from microspore derived embryos of F1 hybrids between Brassica napus and Brassica juncea. In: The Proceeding of The 11th International Rapeseed Congress, pp.132.

Licher, R. (1985). From microspores to rape plants : a tentative way to low glucosinolate strains. In: Sorensen H (ed) cruciferous crops: production, utilisation, description,vol II. Nijhoff/Junk, Dordrecht Boston Lancaster,pp:68-277.

Lichter, R. (2004). Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspore of different Brassicacea species. Plant Breeding, 103 : 119 -123 .

Maheshwari, S. C., Rashid, A. and Tyagi, A. K. (2003). Anther pollen culture for production of haploids and their utility, IAPIC Newsl, 41: 2-7.

Matzk, F. and Mahu, A. (1994 ). Improved techniques for haploid production in wheat using chromosome elimination. Plant Breeding, 113 : 125 -129 .

Mizushima, U. (1950). Karyogenetic studies of species and genus hybrids in the tribe Brassicaceae of Cruciferae. Tohoku Journal of Agriculture Research, 1: 1-14.

Mohan Jain, S., Sopory, S. K. and Veilleux, R. E. (2003). In vitro Haploid production in Higher Plants. Volum1- 4, Kluwer Academic Publishers .

Mollers, C. and Albrecht, S. (1994). Screening herbicide effect on lipid metabolism of storage lipids by in vitro culture of microspore–derived embryoids of Brassica napus. Journal of Plant Physiology.144: 376-384.

Ohkawa, Y. and Maeda, M. (1992). A role of amino acids in embryogenesis of isolated Brassica napus microspores. In : Plant Tissue Culture and Gene Manipulation for Breeding and Formation of Phytochemicals, eds., Oono, K. et al, NIAR, Japan , pp.197-202.

Palmer, C. E., Keller, W. A. (1999).Haploidy. In: Gomez-cambo, C. (ed), Biology of Brassica Coenospecies. Elsevier Science B.V.All rights reserved. pp : 247 -286.

Palmer, C. E., Keller, W. A. and Arnison, P. G. (1996). Exprimental haploidy in Brassica species . The proceeding of the 8th International rapeseed Congress, eds., Jain, S. M., Sopory, S. K. and Vielleux, R. E. Vol.3. pp : 141 -170 . Kluwer Academic Publishers, Germany .

Pauls, K. P., Van Deynze, A., Deslauriers, C., Powell, A., Siebel, J., Cloutier, S., Lo, K. H., Fuchs, K. and Fu, C. Y. (1994). Microspore culture of Brassica napus- a method for haploid production and a model system for studying embryogenesis in plants, Current Topics in molecular and Genetics, 2 : 35 -51 .

Pechan P. M. and Keller, W. A. (1988). Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus. Physiology of Plant, 74 : 377 -384 .

Pechan P. M., Bartels, D., Brown, D. C. W. and Schell, J. (1991). Messengers RNA and protein changes associated with induction of Brassica microspore embryogenesis. Planta, 184 : 161 -165

        Peng, S., Takahata, Y., Hara, M., Shono, H. and Ito, M. (1994). Effect of matrix potential of culture medium on plant regeneration of embryo derived from microspore of Brassica napus. Journal of SHITA, 5/6: 8-14.

Pickering, R. A. and Devaux, P. (1992). Haploid production approaches and use in the plant breeding. In: Genetics, Biochemistry, Molecular Biology and U.K. CAB International, ed., Shewry, P. R. Barly, pp : 519 -547 .

Pierik, R. L. M. (2004). In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publishers, P : 344 .

        Poehlman, G.M. and Mitton.j. (2003). Breeding Field crops.Van Nostrand Reinhold. Newyork. P:724.

Poehlman, G. M. and Sleper, D. A. (1995). Breeding Field Crops. Van Nostrand Reinhold. New York, USA.

Razdan, M. K. (1995). An Introduction to Plant Tissue Culture. Oxford and IBH Publishing Co.U.K.

Roulund, N., Hansted, L., Anderson, S. B. and Feresveit, B. (1990). Effect of genotype, environment and carbohydrate on anther culture response in head cabbage. Euphytica, 49 : 237 -242 .

Sangwan, S. and sangwan-Noreel, B. S. (1996). Cytological and biochemical aspects of in vitro androgenesis in higher plants. In vitro Haploid Production in Higher Plants, Vol,1. eds. Jain, S. M., Sopory, S. K. and Viellux, R. E. Kluwer Academic, Dordrecht, pp : 95 -109.

Sato, T., Nishio, T. and Hirai, M. (1989). Culture condition for the initiation of embryogenesis from isolated microspore in Chinese cabbage (Brassica campestris L.).

Sauer, F. D. and Kramer, J. K. G. (1983). The problem associated with the feeding of high erucic acid rapeseed oils and some fish oils to experimental animals . Academic Press, New York, pp . 254 -292.

Senaratna , T. , Kott, L. , Beversdorf, D. W. and McKersie, D. (2004). Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rape ( Brassica napus L. ). Plant Cell Reports, 10 : 342 -344 .

Siebel, J. and Pauls K. P. (1989a). A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus. Theoretical and Applied Genetics, 78 : 473 -479 .

Siebel, J. and Pauls K. P. (1989b ). Inheritance patterns of erucic acid continent in population of Brassica napus microspore-derived spontaneous haploids. Theoretical and Applied Genetics, 77 :489 -494 .

Simmonds, D. H. and Keller W. A. (1998). Significance of preprophase bands of microtubuls in the induction of microspore embryogenesis of Brassica napus. Planta , 208 : 383 -391 .

Skriver , M. and Mundy , J. (1990). Gene _expression in response to abscisic acid and osmotic stress. The Plant Cell , 2 : 503 -512 .

Stewart , C. and Voetberg , G. (1985). Relationship between stress induced ABA nad proline accumulation and ABA induced proline accumulation in excised barley leaves . Plant Physiology , 79 : 24 -27 .

Swanson, E. B. and Erickson, L. R. (2005). Haploid transformation in Brassica napus using an octopine-producing strain of Agrobacterium tumefaciens. Theor Appl Genet, 78: 831-835.

Swanson, E. B., Coumans, M. P., Ching, Wu. S., Barsby, L. and Beversdorf, W. D. (1987). Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos from Brassica napus. Plant Cell Reports, 6 : 94 -97 .

Taji, A., Kumar, P. P. and Lakshmanan, P. (2000). In vitro plant breeding. (text book ) Food Products Press .

Takahata , Y. , Wakui , K. and Kaizuma , N. (1992 ). A dry artificial seed system for Brassica crops . Acta Horticulturae , 1 : 317 -322 .

Takahata, Y. (1997). Microspore culture. In: Recent Advances in Oilseed Brassica, eds. Kalia, H. R. and Gupta, S. K., pp: 160-181. Kayani Publishers, Ludhiana.

       Takahata, Y. and Keller, W. A. (1991). High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L. Plant Science, 74: 235­242.

Takahata, Y. and Keller, W. A. ( 1995). High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of B. oleracea L. Plant Science. 74 :235 -242 .

Takahata, Y., Brown, D. C. W. and Keller, W. A. (1991). Effect of donor plant age and inflorescence age on microspore culture of Brassica napus. Euphytica, 58 : 51 -55 .

Takahata, Y., Brown, D. C. W., Keller, W.A. and Kaizuma, N. (1993). Dry artificial seeds and desiccation tolerance induction in microspore-derived embryos of broccoli. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 35: 121-129.

Tanaka, I. and Ito, M. (1981). Control of division patterns in explanted microspores of Tulipa gesneriana. Protoplasma, 108: 329-340.

Telmer, C. A., Newcomb, W. and Simmonds, D. H. (1993 ). Microspore development in Brassica napus and the effect of high temperature on division in vivo and in vitro. Protoplasma, 172 : 154 -165 .

Telmer, C. A., Newcomb, W. and Simmonds, D. H. (1995). Cellular changes during heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus cv. Topas . Protoplasma, 185 : 106 -112 .

Telmer, C. A., Simmonds, D. H. and Newcomb, W. (2004). Determination of development stage to obtain high frequencies of embryogenic microspores in Brassica napus. Physiology of Plant, 84 : 417 -424 .

Thurling, N. and Chay, P. M. (2003). The influence of donor plant genotype and environment on production of molticellular microspores in cultured of Brassica napus spp. Annual Botany, 54: 681-693.

Touraev, A., Vicente, O. and Vicente, O. (1997). Induction of microspore embryogenesis by stress. Trends Plant Science, 2 : 297 -302 .

Wakui , K. , Takahata , Y. and Kaizuma , N. (1994). Effect of abscisic acid and high osmoticum concentration on the induction of desiccation tolerance in microspore derived embryos of Chinese cabbage ( Brassica campestris L. ) . Breeding Science , 44 : 29 -34 .

Wakui , K. , Sato , C. , Takahata , Y. and Kaizuma , N. (1998). Long-term storage and cryopreservation of desiccated microspore-derived embryos in ( Brassica napus L. ). Plant Biotechnology , 15 : 123 -126 .

Wakui, K. , Takahata, Y. and Kaizuma, N. (1999). Scanning electron microscopy of desiccation-tolerant and -sensitive microspore-derived embryos of ( Brassica napus L. ) . Plant Cell Reports , 18 : 595 -600 .

Wang M., Van Bergen S. and Van Duyijn B. (2000). Insights into a key developmental switch and its importance for efficient plant breeding. Plant Physiology, 124:5213-530.

Wang, X . , Loh, C. , Yeoh, H. and Sun, W. (2002). Drying rate and dehydrin synthesis associated with abscisic acid-induced dehydration tolerance in Spathoglottis plicata protocorms . Experimental Botany , 53: 551-558.

Wilen , R. (1992). Gene _expression in microspore embryos. Ph.D. Thesis.University of Calgary, Calgary , Alberta , Canada .

Yang, Q., Chauvin, J. E. and Herve, Y. (2004) . A study of factors affecting anther culture of cauliflower (Brassica oleracea). Plant Cell, Tissu and Organ culture , 28 : 289 -296 .

Zaki, M. A. M. and Dickinson, H. G. (1990) . Structural changes during the first division of embryos resulting from anther and free microspore culture in Brassica napus. Protoplasma, 156 : 149 -162 .

Zaki, M. A. M. and Dickinson, H. G. (1995). Modification of cell development in vitro: The effect of colchicine on anther and isolated microspore culture in Brassica napus. Plant Cell Tissue Organ culture 40: 255-270.

Zhang , F. , Aoki , S. and Takahata , Y. (2003). RAPD markers linked to microspore embryogenic ability in Brassica crops . Euphytica , 131: 207 -2123 .

Zhang, F. L. and Takahata, Y. (2001). Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops . Theorrical Application of Genetic, 103 : 254 -258 .

Zhao, J. P., Simmonds, D. H. and Newcomb, W. (1996). Induction of embryogenesis with colchicine instead of heat in microspores of  Brassica napus. Planta, 98: 435-439

Zhao, J. P., Simmonds, D. H. and William, N. (1996). High frequency production of doubled haploid plants of Brassica napus cv. Topas derived from colchicines-induced microspore embryogenesis without heat shock. Plant Cell Reports, 15 : 668 -671 .

Zhau,H. and Konzak, C. F. (2005 ). Improvment of anther culture methods for haploid production in wheat. Crop Science. 29 : 817 -821 .

Zhong, W. J., Fang, G. H., Tang, K. X., Zhang, Z. Q. and Yu, M. J. (2005). Plant regeneration from embryod through isolated microspore culture in Brassica napus L. GCIRC Congress, pp : 1071 -1074, Canada .